高扬 研究员 银川市兴庆区畜牧水产中心
2013年9月18日
由于抗生素在水产养殖业中的大量甚至盲目使用，病原菌对其所产生的抗药性以及在养殖动物中的残留等毒副作用日益突出，这给人类自身的食品安全和养殖水域环境以及生态环境都带来了很大的危害。广大水产养殖科技人员一直都在积极寻求替代抗生素的新型水产养殖用制剂，如中草药制剂、酶制剂、微生态制剂等。实践表明，这些新型制剂均具有良好的应用前景，是生产安全、环保、无公害、绿色水产品的有力保证。
微生态制剂大致可分为改善水质的水质调节剂、控制病原的微生物控制剂以及促生长作用的饵料添加剂3大类。与光合细菌、芽孢杆菌、乳酸杆菌和酵母菌等相比，蛭弧菌是近些年发展起来的一种微生态制剂，首先成功运用在畜禽养殖业，用于防治畜禽肠道细菌性传染病，此后在水产养殖业中也逐渐被人们用于防治鱼虾蟹等水产动物的细菌性疾病，均取得了良好的效果。
蛭弧菌的生物学名称为噬菌蛭弧菌。蛭弧菌是一类专门捕食细菌的寄生性细菌，具有独特的裂解细菌的生物学特性，能够在较短的时间内裂解水体中的沙门氏菌属(Salmonella)、志贺氏菌属(Shiglla)、变形杆菌属(Proteus)、埃希氏菌属(Escherichia)、假单胞菌属(Pseudomonas)、欧文氏菌属(Erwina)、弧菌属(Vibri)等属的种类，可将致病菌限制在较低水平上，同时还可有效地控制养殖水体的COD、硫化物和氨氮存留量，因此，利用其这一特性作为水产养殖水体的生物化物和“活性抗生素”具有广泛的发展前景，对开拓水产养殖动物疾病防治新途径具有重要意义。
1、蛭弧菌的生物学特性及作用机理
蛭弧菌为一种广盐性革兰氏阴性菌，依据伯杰氏(B ergey’s)细菌鉴定手册蛭弧菌属于薄壁菌属、共有四种：噬菌蛭弧菌(Bdellovibrio bacteriouorus简称Bd菌)、斯托普弧菌(Bd．stolpii)、斯塔尔蛭弧菌(Bd．starrii)和一种未命名的海水菌株。 在自然界中分布非常广泛，普遍存在于各种水域以及土壤之中，一般凡有细菌的地方都有它们的存在。其大小为(0．25～0．40) u m X(0．8～1．2) u m，具有一般细菌的特性，比普通细菌小，有类似噬菌体的作用。蛭弧菌有弧状、杆状、球形及球杆状等4种基本形态，其鞭毛有极生单鞭毛、极生双鞭毛以及极生三鞭毛3种类型。由于蛭弧菌菌体尾部具有长鞭毛，其运动极其活泼，相差显微镜下可见其作跳跃式运动。蛭弧菌的生长温度范围在4～37℃，最适生长温度在25～30℃；在pH3．0～9．8均能生长，最适pH值为7．2～7．6。蛭弧菌对热敏感，50℃以上时，30分钟失去活性；40℃时30分钟活性减少一半。
寄生和裂解细菌是蛭弧菌独特的生物学特性。其对大多数革兰氏阴性细菌，如志贺氏菌属、沙门氏菌属、埃希氏菌属、欧文氏菌属、变形杆菌属、弧菌属、假单胞菌属、气单胞菌属等细菌均具有较强的裂解活性。部分革兰氏阳性细菌，如枯草杆菌和金黄色葡萄球菌等也能够被蛭弧菌裂解。此外，蛭弧菌对部分病毒、钩端螺旋体以及某些藻类也具有寄生或侵染作用。
蛭弧菌对宿主菌的裂解与它的生长密切相关，其生长大致分为攻击期以及裂解繁殖期。首先，处于进攻状态的蛭弧菌依靠鞭毛运动极其活泼，在相差显微镜下可见其呈跳跃式积极追捕宿主菌，它与宿主细胞激烈碰撞后以无鞭毛的一端吸附到宿主细胞上面，菌体高速转动，通过释放聚糖酶、脱乙酰酶和肽酶等来穿透宿主菌的外膜和肽聚糖，进入宿主菌的周质空间，侵入过程很快，只需要几秒钟。随后，蛭弧菌脱去鞭毛，失去运动性，进入体内的裂解繁殖生长期。由于蛭弧菌的侵入，宿主菌因渗透压改变而涨大成圆球状并立刻死亡，成为蛭弧菌的生长空间一蛭质体。在蛭质体里蛭弧菌以宿主菌的原生质为营养物质，菌体生长为长的螺旋状，其长度和宿主细胞的空间大小有关。经过一定时间后，蛭质体被完全溶解，菌体分裂成与原来蛭弧菌外形相似的小片段，各小段长出鞭毛形成新的蛭弧菌个体，完成这一繁殖全过程约需4～6小时。最后，随着细胞增殖以及产生某些溶菌酶使宿主菌细胞壁分解，蛭弧菌子代细胞随即被释放出来进入新的生长周期。蛭弧菌在宿主菌中的生长过程不依赖于宿主菌的新陈代谢，可以直接利用宿主菌细胞的各种物质。
Thomashow等提出了。蛭弧菌的“穿入、稳定、裂解”模型，即首先蛭弧菌通过化学趋避性识别，并吸附宿主细菌，然后通过酶解和机械钻孔等一系列反应，进入宿主细菌的质壁空间或细胞质，对宿主细胞进行一系列的修饰与改造，同时进行自身生物大分子合成，最终分裂形成子代蛭弧菌并释放到宿主细胞外。蛭弧菌为细胞内寄生物，整个生活周期可分为识别、侵入、穿入宿主菌体、生长发育、裂解宿主、释放子代蛭弧菌。
2、蛭弧菌在水产养殖中的应用概况
1979年我国开始对噬菌蛭弧菌的研究 ；农业部1994年37号文批准噬菌蛭弧菌微生态制剂为国家二类新兽用生物生态制品；1996年农业部批准噬菌蛭弧菌微生态制剂规模化生产；1996年国家科技部把噬菌蛭弧菌微生态制剂项目列为国家火炬计划项目；1996年国家科技部把噬菌蛭弧菌微生态制剂项目列为国家重大科技成果项目，并同意使用国家火炬标志和国家火炬中心共同开发、生产；国家科技部火炬中心、中国民协共同实施噬菌蛭弧菌微生态制剂项目的决定。
噬菌蛭弧菌属内只有噬菌蛭弧菌专营寄生生活，其他的两个种的噬菌蛭弧菌营兼性寄生或腐生（非寄生）生活。噬菌蛭弧菌微生物生态制剂为我国首创，目前国外市场没有噬菌蛭弧菌微生物生态制剂。国家农业部批准生产噬菌蛭弧菌微生物生态制剂的菌株就是指专营寄生生活的噬菌蛭弧菌菌种。
目前蛭弧菌已商品化生产，并在水产养殖业中广泛应用。其主要生产单位和产品有：宝来利来(泰安)兽药饲料公司的淡水水产动物专用噬菌26(噬菌蛭弧菌溶液)，广东省新的生物工程研究所有限公司的复合噬菌蛭弧菌，南京(香港)威力克生物有限公司的鱼虾宝、蟹宝、鳝宝、蛙宝、鳗鱼宝、虾宝，南京福润德动物药业有限公司的三联噬菌皇(水产动物专用)，SPSinc．燕金科技发展有限公司的百得菌、噬菌蛭弧菌多株冻干粉型活菌制剂，江苏省海洋水产研究所的克菌1号——噬菌蛭弧菌生态制剂，南京特安科贸有限公司的解毒养水宝，北海兰大生物科技公司的鱼虾神等。
水产养殖业迅猛发展的同时，养殖废水及底泥污染不仅给环境造成巨大压力，使养殖水域环境恶化，养殖池塘的自净与调节能力下降。水产养殖水域中的主要污染物是残饵、鱼类排泄物，含N、P的营养盐类。这些污染物的积累会导致养殖水体中化学需氧量(COD)、氨氮(NH+4—N)、亚硝酸盐氮(NO-2—N)等严重超标，影响鱼类的生长和生存。研究表明：生产lkg的鱼类生物量估计可产生162g有机物的粪便废物，其中包含50g蛋白质、31g脂质和81g碳水化合物，营养盐废物产生量包括8g蛋白氮和22g氨态氮，合计为30g的总氮及7g的总磷。由此可见，约有51％的氮和64％的磷成为废物，其结果导致鱼虾病害频频发生，水产养殖生物存活率和产量下降，给经济造成很大损失。因此改善水产养殖水域环境已受到广泛的关注和研究。
水产养殖水体的处理方法主要有化学药物处理、物理消毒和微生物调控等方法。用化学消毒法和物理消毒法消毒养殖塘水，除会导致病原菌产生抗药性和污染水域的副作用外，同时还会杀害水中有益微生物。造成微生物生态失调，破坏水中的生态环境，而且水环境经过消毒后，只能是暂时无病原菌，随着引进新水等又难免带进病原菌。因此，对水环境进行消毒，需考虑到水中微生物生态环境，而微生物作为一种生态调节剂，治理养殖水环境可以明显的改善水质，增加溶氧(DO)，降低氨氮(NH+4—N)与亚硝酸氮(NO-2—N)，抑制有害微生物的繁殖，降解有机物，改善养殖生态环境，同时因具有成本低、收效大、无二次污染等优点，因此生态防治才是唯一的出路。
蛭弧菌在水产养殖业中应用前景十分广阔。主要用途有：一是蛭弧菌是水产养殖动物病害生物防治的一种新工具，利用蛭弧菌迅速有效地裂解淡水养殖水体主要的条件致病菌——嗜水气单胞菌，减少水体致病微生物的数量，进而降低了细菌性病害的发生率，它对水中大肠菌群的清除作用相当明显,可控制和减少池塘中细菌性疾病发生，能防止或减少鱼类病害的发展和蔓延。是细菌性疾病防治的“活性抗生素”。二是蛭弧菌是水产养殖水体的生物改良剂，可氧化、降解氨氮，降低氨氮含量，净化水体, 提高透明度, 改善养殖水体环境。与光合细菌合用，还有控制养殖水体的COD、硫化物等作用。为养殖鱼类创建良好水质环境。
3、蛭弧菌应用前景
自1994年农业部把蛭弧菌列入饲料药物添加剂允许使用的微生物有益菌类中以后，蛭弧菌的使用在国内已得到认可。目前，蛭弧菌作为一种有益微生物已经在鱼、虾、蟹以及贝类等水产养殖动物中得到成功运用且收到良好效果。结果表明：蛭弧菌的宿主范围广泛，对水产动物常见致病菌都有较强的清除作用，其对致病菌的裂解能力明显大于非致病菌，在清除致病菌的同时，对养殖环境中的有益细菌危害不大，这是抗生素类药物不能做到的。目前蛭弧菌已经能和光合细菌、芽孢杆菌以及酵母菌等制成复合微生态制剂并且在鱼以及虾蟹类养殖动物中得以成功运用。此外，很少有抗蛭弧菌的细菌突变株，蛭弧菌能对致病菌发挥持续稳定的裂解作用，蛭弧菌在缺少或没有宿主菌存在的环境中其数量会自行下降甚至会因“饥饿”而死，使用蛭弧菌制剂不会存在残留问题。
迄今为止研究报道表明蛭弧菌对人和某些动物无毒害作用。
我区水产繁殖、养殖的温度范围分别在18～27℃和10～28℃，养殖水体的pH在7．5～8．6，盐度千分之3以下。蛭弧菌作为一种广盐性细菌，其生长温度范围在4～37℃，在pH3．0～9．8范围内均能生长。可见，我们的水域养殖基本条件完全满足蛭弧菌正常生长和繁殖的需要，加之寄生和裂解细菌是蛭弧菌独特的特性，其对大多数革兰氏阴性细菌，尤其是气单胞菌属等常见的条件致病菌均有较强的裂解活性，而这些细菌大多又是我们养殖鱼类的主要病原菌。同时，蛭弧菌为兼性厌氧菌，在有氧及缺氧条件下都能生存且发挥作用，受光照、天气变化等外界条件影响小，适应性较强，只要其在养殖条件中得以成功生长和繁殖，其完全可以将这些致病菌的数量控制在一定数量范围之内。尽管有研究表明，当宿主菌低于一定数量时，蛭弧菌裂解能力也相应下降，这样蛭弧菌与宿主菌形成一种动态平衡，无法达到最终清除所有致病菌的目的，只能将其控制在一定数量范围之内，其中原因还有待进一步研究，但只要能将那些致病菌特别是条件致病菌控制在危害水平以下，对于鱼类的疾病预防来说就达到了目的。
4、应用中注意事项
1）水质因子影响蛭弧菌裂解嗜水气单胞菌
上海水产大学的钱云云和曹海鹏，以一株具有致病力的温和气单胞菌作为筛选宿主菌，从异育银鲫肠道中分离到一株蛭弧菌（暂命名为BDF-H16），进行了“水质因子对蛭弧菌裂解嗜水气单胞菌的影响”研究，结果如下：
a、温度：在温度为15℃～33℃条件下，蛭弧菌BDF-H16对嗜水气单胞菌均能裂解，最适裂解温度为28℃，低温不利于蛭弧菌对嗜水气单胞菌的裂解。
b、pH：在pH5.5～9.0的条件下，蛭弧菌BDF-H16对嗜水气单胞菌均能裂解，裂解活性最高的pH为7.0～7.5，而在pH5.5～6.5和pH8.5～9.0时的裂解活性相对较低。
c、Ca2+：在Ca2+浓度0～5.0mmol／L范围内时，对蛭弧菌裂解嗜水气单胞菌具有一定促进作用，以Ca2+浓度为0.5mmol／L时的裂解活性最高，而当浓度达10.0mmol／L时，裂解活性开始下降。
d、Mg2+：当Mg2+浓度在2～2.0mmol／L时，蛭弧菌对裂解除嗜水气单胞菌具有一定促进作用，Mg2+浓度为0.5mmol／L时的裂解活性最高，当Mg2+浓度大于5.0mmol／L时，裂解活性开始降低。
e、NH4+：NH4+浓度对蛭弧菌裂解嗜水气单胞菌具有一定影响，情况是随着NH4+浓度的升高，蛭弧菌BDF-H16对嗜水气单胞菌的裂解活性降低。当NH4+浓度在0.2mg／L时，产斑数目较对照组少23.0％而当NH4+浓度为0.8mg／L时，产斑数较对照组少64.7％。
f、N02-：N02-对蛭弧菌裂解嗜好水气单胞菌也有一定影响。当N02-浓度在0.05mg／L～0.30mg／L时，对裂解有一定促进作用，其中以浓度为0.30mg／L时的裂解活性最高，产斑数较对照组高1.6倍，但当浓度在0.5mg／L时，裂解活性开始下降，产斑数目降低为对照组的50.9％。
2) 药物影响蛭弧菌生长和吸附
恩诺沙星(Enrofloxacin简称EF)．是第三代喹诺酮类药物，已广泛用于我国水产动物细菌性疾病的防治。由于养殖生产者缺乏科学用药知识，在进行水产养殖病害防治用药时，往往超剂量使用恩诺沙星，势必会影响蛭弧菌的生存。研究表明，在固体培养条件下，恩诺沙星对蛭弧菌BDF-H16噬菌斑的产生具有抑制作用，而且随着恩诺沙星浓度的升高，抑制作用越大；在液体培养条件下，蛭弧菌BDF-H16的增殖浓度随着恩诺沙星浓度的增高而降低。但10ug／mL恩诺沙星并没有改变蛭弧菌的生长趋势；而当在液体培养基中添加沸石时，蛭弧菌的吸附量随恩诺沙星含量的增加而逐渐降低。
3）蛭弧菌对有益微生物也具有裂解作用
利用水产养殖上常使用的酵母菌、枯草芽孢杆菌、硝化细菌作为宿主，同时以嗜好水气单胞菌为对照，除宿主菌为硝化细菌的双层平板没能形成噬菌斑外，其余均有噬菌斑产生，但有益菌相对于嗜好水气单胞菌的出斑时间明显滞后，说明蛭弧菌对致病菌的裂解能力强；水中裂解实验验证8天后酵母菌数目的对数值较起始值下降了0.59，枯草芽孢杆菌数目的对数值下降1.1，而嗜水气单胞菌下降了2.8。说明蛭弧菌对致病菌的裂解能力比非致病菌强，但也能影响水体中的有益菌存在，因此，在使用中要注意不要随意与有益菌配伍。
4）避免高温保存
当前，蛭弧菌制剂在生产、加工、浓缩、包装、运输等生产过程中，都能保持较高的生存率和较强的生命力，适合大规模生产，且易于保存、储藏和运输，常温下保存期可达半年以上。不足的是国内在用的蛭弧菌产品主要为液体制剂，剂型比较单一，且不耐高温，总之，它在水产养殖中的运用也将会越来越广泛。蛭弧菌将作为一种“生物渔药”必将产生巨大的经济价值以及良好的社会效应。
